Ingénieur / Ingénieure de recherche scientifique (H/F)
Mission :
Mener un stage de recherche de 3 ans dans le cadre du projet im
HODA. Il est demandé de valoriser les travaux via des communications orales, poster et par au moins une publication dans une revue internationale avec comité de lecture. Ces travaux se feront à travers une collaboration avec le laboratoire de l'IMFT sous la direction de Mme Pauline Assémat.
Activités :
WP1. Génération d'organoïdes / caractérisation moléculaire.
T1.1 Cultures 3D d'organoïdes. Des cellules souches mésenchymateuses médullaires (BM-MSC) issues de donneurs d'âges différents (jeunes vs âgés) seront cultivées en 3D ; elles formeront spontanément des organoïdes ostéogéniques en 7 jours, selon une méthodologie décrite dans nos travaux précédents (publiés et brevetés). Par ailleurs, des organoïdes contenant des cellules sénescentes seront obtenus par co-culture de MSC avec des MSC rendues sénescentes par induction de stress. Les organoïdes seront collectés quotidiennement pour des analyses 3D utilisant diverses techniques de microscopie, ainsi que des analyses de biologie moléculaire (RT-q
PCR quantitative), afin de caractériser l'expression de marqueurs ostéoblastiques (voir Tâche 1.2).
T1.2 Caractérisation des organoïdes par imagerie (microscopie confocale, biphotonique, microscopie à feuille de lumière (lightsheet) et microscopie confocale 3D dédiée aux organoïdes) et par RT-q
PCR quantitative. L'objectif est d'évaluer l'engagement lignée, les marqueurs de sénescence, les facteurs associés au phénotype sécrétoire lié à la sénescence (SASP), la différenciation vasculaire et la structure tissulaire, grâce à une imagerie 3D à haut contenu (high-content imaging).
T1.3 Évaluation fonctionnelle du cil primaire. Différents marqueurs (ARL13B, γ-tubuline) seront utilisés pour visualiser le cil primaire dans les organoïdes, qu'ils contiennent ou non des cellules sénescentes. La longueur des cils primaires sera également mesurée, car elle influence la fonction de cette structure.
Détails techniques : Organoïdes : Des BM-MSC immatures, isolées à partir de têtes fémorales ou de crêtes iliaques (issues de donneurs sains, équilibrés en termes de sexe et d'âge - jeunes/âgés), sont amplifiées en 2D, puis cultivées en 3D (agrégation induite en conditions de très faible adhérence) selon nos protocoles standardisés. Les MSC sénescentes sont obtenues par des traitements génotoxiques ou par exposition à des cytokines inflammatoires (phénomène de sénescence induite par le stress (SIPS) ; caractérisé par un marquage γH2AX, la présence d'inhibiteurs de CDK, une diminution de la lamine B1 et une augmentation des facteurs SASP). L'engagement dans la lignée ostéoblastique est évalué par RT-q
PCR, immunobuvardage (Western blot) et microscopie 3D des marqueurs d'ostéogenèse ; les structures vasculaires sont identifiées grâce à des marqueurs endothéliaux et des marqueurs de péricytes (visualisation 3D par microscopie confocale et microscopie à feuille de lumière, système Opera Phenix® Plus HCS ; projet RESTORE).
